Grundlagen:

Harnstoff wird in wässriger Lösung von Urease bei Raumtemperatur in Ammoniak und Kohlenstoffdioxid gespalten. Der freigesetzte Ammoniak reagiert dabei mit dem Lösungsmittel unter Bildung von Ammoniumionen und Hydroxidionen. Die Folge ist eine Zunahme des pH-Wertes, die sich jedoch auf die Aktivität des Enzyms auswirkt. Um die Aktivität des Enzyms konstant zu halten wurden die Messungen in gepufferter Lösung durchgeführt. Als Puffer wurde ein  Kaliumdihydrogenphosphat / Dinatriumhydrogenphosphat - Puffer (pH 8,0) verwendet. Die messbare Änderung der Leitfähigkeit beruht hier auf einen Übergang der Dihydrogenphosphationen in die besser leitfähigen Hydrogenphosphationen, verursacht durch die Reaktion zwischen Hydroxidionen und Dihydrogenphosphationen. Die Leitwertzunahme ist damit proportional der Menge an gespaltenem Harnstoff und wird mit Hilfe der Leitwertsonde aufgezeichnet.
Mit Hilfe der Michaelis-Menten-Gleichung wird aus einer Lineweaver-Burk-Auftragung die Michaelis-Konstante ermittelt.

Chemikalien und Geräte: 

Versuchsaufbau:

Vorbereitung Hardware:

Vorbereitung Software: 

Vorbereitung Chemie: 

• Herstellen  von 600 ml des Kaliumdihydrogenphosphat / Dinatriumhydrogenphosphat - Puffers (pH 8,0): siehe Chemikalien.
• 250 ml-Bechergläser: Jeweils 50 ml des Puffers werden mit Harnstoff versetzt, so dass man Lösungen der folgenden Harnstoff-Konzentrationen erhält: 2,0 mmol/l; 6,0 mmol/l; 12 mmol/l; 20 mmol/l und 30 mmol/l.
• Man stellt 5 Urease-Lösungen her, in dem man jeweils 50 mg Urease in 50 ml des Puffers löst.

Versuchsdurchführung:

Man gibt die 50 ml Urease-Lösung in das mit Harnstofflösung gefüllte Becherglas, in das die Leitwertsonde eintaucht.
 

• Schalter "1" 

Nach 15 - 20 Minuten wird die Messung beendet:

• Schalter "0" 

Anschließend können noch weitere Messungen mit anderen Substrat-Konzentrationen durchgeführt werden. Dazu wird unter Chemex (Version 1.5) Messung1 mit einem Häkchen versehen. Dann Messung2 angeklickt und die 2. Messkurve aufgenommen, usw.

• Messungen abspeichern

Qualitative Auswertung:

  Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration:

Mit abnehmender Substratkonzentration nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit (Steigung der aufgezeichneten Kurven) ab.

Messung weiterer Abhängigkeiten:

• Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Enzymkonzentration.
• Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Temperatur.
• Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit vom pH-Wert.

Quantitative Auswertung

Aus der zeitlichen Änderung des Leitwertes kann unter Verwendung der verschiedenen Messungen die Michaeliskonstante für dieses Enzym berechnet werden. Dazu ermittelt man aus jeder Messung im Zeitintervall 0 bis 4 Minuten die mittlere Reaktionsgeschwindigkeit als Quotient aus der Leitwertänderung und dem Zeitintervall. Trägt man den Kehrwert dieser Reaktionsgeschwindigkeit gegen den Kehrwert der Harnstoffkonzentration auf, so erhält man eine Gerade. Nach Lineweaver und Burk gilt:
Der Achsenabschnitt im negativen Bereich - 1/c_(Harnstoff) entspricht 1/K_M