Enzymkinetik: Hydrolyse von Harnstoff

Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration (Enzymkonzentration, pH-Wert und Temperatur).

Felix Halbach (LK Chemie, Prien am Chiemsee), Dr. Gabriel Hetz (Gymnasium Eckental), 4.1.2000



Ziel:

Bestimmung des Einflusses unterschiedlicher Substratkonzentrationen auf die Geschwindigkeit der enzymatischen Harnstoffspaltung. Ermittlung der Michaelis-Konstanten.



Grundlagen:

Harnstoff wird in wässriger Lösung von Urease bei Raumtemperatur in Ammoniak und Kohlenstoffdioxid gespalten. Der freigesetzte Ammoniak reagiert dabei mit dem Lösungsmittel unter Bildung von Ammoniumionen und Hydroxidionen. Die Folge ist eine Zunahme des pH-Wertes, die sich jedoch auf die Aktivität des Enzyms auswirkt. Um die Aktivität des Enzyms konstant zu halten wurden die Messungen in gepufferter Lösung durchgeführt. Als Puffer wurde ein  Kaliumdihydrogenphosphat / Dinatriumhydrogenphosphat - Puffer (pH 8,0) verwendet. Die messbare Änderung der Leitfähigkeit beruht hier auf einen Übergang der Dihydrogenphosphationen in die besser leitfähigen Hydrogenphosphationen, verursacht durch die Reaktion zwischen Hydroxidionen und Dihydrogenphosphationen. Die Leitwertzunahme ist damit proportional der Menge an gespaltenem Harnstoff und wird mit Hilfe der Leitwertsonde aufgezeichnet.
Mit Hilfe der Michaelis-Menten-Gleichung wird aus einer Lineweaver-Burk-Auftragung die Michaelis-Konstante ermittelt.


Chemikalien und Geräte: 


Chemikalien   Chembox und Zubehör
  • Harnstoff
  • Urease
  • Dihydrogenphosphat-Hydrogenphosphat-Puffer (pH=8,0):
    Stammlösungen für den Puffer: jeweils 0,5  molare KH2PO4 - Lsg. und Na2HPO4 - Lsg.
    Für pH=8,0 werden 2,80 ml KH2PO4 und 32,4 ml Na2HPO4 auf 1000 ml mit Aqua dest. aufgefüllt.
 
  • Chembox CB2 
  • Leitwertsonde DLS
     
Stativmaterial   Glasgeräte
  • Stativfuß mit Stativstangen
  • 1 Doppelmuffe
  • 1 Universalklemme
 
  • Pipetten
  • Bechergläser
     
Sonstiges    
  • Magnetrührer
  • Waage
   

Versuchsaufbau:


Vorbereitung Hardware:

 

Sensor anschließen an Chembox-Eingang:
Leitwertsonde   K5: Leitwert

Vorbereitung Software: 


Messen     
Festlegen der Meßgrößen Einstellen  Kanalbelegung:
Kanal  Formel  Größe  Einheit  Name
Blau K5 G S Leitwert
Auswahl der verwendeten Sonden und Eichung   Chembox:
Anklicken  Pool  Kalibrierung  
Leitwert K5 Leitwertsonde entfällt OK
Meßbereich einstellen   Kanalbelegung:
Eines der farbigen Kanal-Quadrate anklicken. 
Es öffnet sich die Dialogbox "Meßbereich
Meßgröße Meßbereich
Leitwert 0,0 bis 4,0 E-3 S
     
Steuerleiste     
  Optionen Meßtakt: 30 s
     

Vorbereitung Chemie: 

  • Herstellen  von 600 ml des Kaliumdihydrogenphosphat / Dinatriumhydrogenphosphat - Puffers (pH 8,0): siehe Chemikalien.
  • 250 ml-Bechergläser: Jeweils 50 ml des Puffers werden mit Harnstoff versetzt, so dass man Lösungen der folgenden Harnstoff-Konzentrationen erhält: 2,0 mmol/l; 6,0 mmol/l; 12 mmol/l; 20 mmol/l und 30 mmol/l.
  • Man stellt 5 Urease-Lösungen her, in dem man jeweils 50 mg Urease in 50 ml des Puffers löst.

Versuchsdurchführung:


Messen       
  Schreiber
Anklicken  Auswahl 
Y-Farbmarke Leitwert
X-Farbmarke Zeit
Auswahl der x- und y-Achse
       
    Symbolleiste (rechts)
  • Linienbreite "dick" aktivieren 
 

Man gibt die 50 ml Urease-Lösung in das mit Harnstofflösung gefüllte Becherglas, in das die Leitwertsonde eintaucht.
 

  • Schalter "1" 


Nach 15 - 20 Minuten wird die Messung beendet:

  • Schalter "0" 

Anschließend können noch weitere Messungen mit anderen Substrat-Konzentrationen durchgeführt werden. Dazu wird unter Chemex (Version 1.5) Messung1 mit einem Häkchen versehen. Dann Messung2 angeklickt und die 2. Messkurve aufgenommen, usw.

  • Messungen abspeichern

Qualitative Auswertung:

  Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration:

Mit abnehmender Substratkonzentration nimmt die Reaktionsgeschwindigkeit (Steigung der aufgezeichneten Kurven) ab.

Messung weiterer Abhängigkeiten:

  • Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Enzymkonzentration.
  • Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Temperatur.
  • Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit vom pH-Wert.

Quantitative Auswertung

Aus der zeitlichen Änderung des Leitwertes kann unter Verwendung der verschiedenen Messungen die Michaeliskonstante für dieses Enzym berechnet werden. Dazu ermittelt man aus jeder Messung im Zeitintervall 0 bis 4 Minuten die mittlere Reaktionsgeschwindigkeit als Quotient aus der Leitwertänderung und dem Zeitintervall. Trägt man den Kehrwert dieser Reaktionsgeschwindigkeit gegen den Kehrwert der Harnstoffkonzentration auf, so erhält man eine Gerade. Nach Lineweaver und Burk gilt:
Der Achsenabschnitt im negativen Bereich - 1/c(Harnstoff) entspricht 1/KM


© Felix Halbach, Dr. G. Hetz, 2000